WGS探索多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药机制

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　　2023年9月，徐州第一人民医院呼吸科团队与迪飞医学合作，在BMC Microbiology（IF=4.2）杂志发表研究型论文。文章对18株临床肺炎克雷伯菌耐多药（MDR-Kp）菌株进行全基因组测序（WGS），分析其耐药基因和耐药机制，通过系统发育分析评估本研究菌株与公共数据库菌株之间的序列同源性。迪飞医学作为共同作者参与了该研究的数据分析与文章撰写。

　　研究背景

　　肺炎克雷伯菌是一种革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科，其感染的常见临床表现包括肺炎、尿路感染、血流感染和伤口感染等。虽然肺炎克雷伯菌通常被认为是医院获得性感染及免疫功能低下宿主感染的机会性病原体，但现已出现了高毒力和多重耐药(MDR)菌株。

　　中国细菌耐药监测网（CHINET）数据显示，在2005-2021年期间，肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南等碳青霉烯类抗菌药物的耐药率增加了8倍(3.0%~23.8%)。从2008年到2016年，耐多药（MDR）菌株的分离率也从0.3%急剧上升至3.5%。且数据显示中国肺炎克雷伯菌耐药性存在显著的地理差异，其中华东地区的分离率明显高于其他地区。考虑到肺炎克雷伯菌感染的临床重要性及其在华东地区的高流行率，深入了解这些新出现的MDR菌株获得抗生素耐药的机制以及菌株之间的差异，对于优化疾病管控至关重要。

　　研究方法

　　本研究收集了18例患者的临床样本，包括痰液、尿液和血液，进行肺炎克雷伯菌的分离培养，菌株样本使用WGS测序进行耐药基因分析，同时院内进行抗菌药物敏感测试（AST）。从BV-BRC数据库中下载87种常见肺炎克雷伯菌菌株序列，与本研究中18例样本的WGS数据一起进行SNP位点分析，构建系统发育树。

　　研究结果

　　临床MDR-Kp菌株的抗菌敏感性

　　通过AST测试了全部MDR-Kp菌株对40种抗生素的抗菌药物敏感性，我们观察到临床分离株对β-内酰胺类抗生素的耐药性很高，且18株肺克培养株均对氨曲南和环丙沙星耐药（表1）。同时只有一株测试菌株（1/10，10%）对头孢菌素类抗生素头孢他啶/阿维巴坦耐药，而所有的测试菌株均对替加环素和多粘菌素B敏感。

表1 药敏试验结果

　　WGS破译MDR-Kp的耐药基因

　　在全基因组测序检测到的42种潜在耐药基因中，我们发现其中25种（43.9%）与已知耐药机制相关，能够通过传统的药敏方法进行评估。耐药基因KPC-2和parC的检出率最高（14/18，77.8％），其次是rmtB和sul2（12/18，66.7％）。评估WGS检测MDR-Kp菌株已知耐药机制的性能，发现对于β-内酰胺类药物，WGS鉴定青霉素耐药菌株的敏感性和准确性均为100%，但在预测肺炎克雷伯菌对头孢噻吩和头孢呋辛的敏感性方面，WGS的检测性能下降了40%（表2）。对于其他常用抗生素，WGS表现中等，准确性达77.8%~100%。

表2 WGS鉴定MDR-Kp菌株耐药机制的性能表现

　　探究MDR-Kp菌株在时间和空间尺度上的遗传变异

　　使用多位点序列分型（MLST）测试来分析MDR-Kp菌株的多样性和复杂性，共鉴定出四种序列类型（ST），其中ST11是主要类型（图1）。这一发现与其他发现一致，表明ST11是中国肺炎克雷伯菌感染的主要原因。

　　基于单核苷酸多态性（SNP）进行了系统发育分析，对研究中的18个MDR-Kp的分离株与之前在中国发现的87个菌株之间的遗传相似性和进化关系进行了比较。结果发现半数菌株与湖南和上海菌株一起聚集在A簇中，6个菌株（33.3%）在B簇中形成不同的分组，而分析结果并未显示这些菌株的分布模式存在任何空间或时间差异。

图1 MDR-Kp菌株在空间和时间尺度上的比较

　　结    论

　　WGS对于识别MDR-Kp菌株中潜在的抗菌药物耐药基因具有重要的临床意义，且WGS揭示的全面基因组信息对于指导临床治疗决策、实现耐药菌监控以及进一步了解细菌耐药机制具有巨大的潜力。

　　该研究使用了迪飞医学mNGS检测技术。

　　参考文献：

　　Yang J, Zhang K, Ding C, Wang S, Wu W, Liu X. Exploring multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae antimicrobial resistance mechanisms through whole genome sequencing analysis. BMC Microbiol. 2023 Sep 2;23(1):245. doi: 10.1186/s12866-023-02974-y. PMID: 37660028; PMCID: PMC10474722.

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